中国科学家首次发现自然界中能独立催化分子间DA反应的单功能酶

▉  原文信息

▉  前言

D-A反应（Diels-Alder Reaction）是合成化学中最有力且用途最广泛的方法之一，很多天然产物的化学结构，包括聚酮化合物、萜类化合物、生物碱等都表明D-A反应参与了其生物合成。尽管推测的Diels-Alderase或广义的[4+2]环化酶被认为参与了许多次级代谢物的生物合成，但科学界所发现的Diels-Alderase也以催化分子内D-A反应为主，少数能够催化分子间D-A反应，而且其中大部分都是多功能酶，直到今天尚未发现天然存在的酶（Diels-Alderase）能够独立催化分子间的D-A反应。

2010年6月7日，在Isao Fujii团队发表的一篇文章中，揭示了SPS（Solanapyrone合成酶）单一酶既能催化氧化反应，又能催化随后的环加成反应。

2003年Isao Tanaka团队发表的文章中介绍了一种天然的Diels-Alderase，即真菌macrophomate合成酶（MPS）与丙酮酸酯的复合物，但是MPS除了能够催化[4+2]环加成反应之外，在一定条件下还能够高效地催化脱羧，因此MPS属于多功能的Diels-Alderase。

除了上述提到的酶以外，洛伐他汀非核苷酸合成酶（LNKS）也是属于多功能Diels-Alderase，不仅催化分子内[4+2]的环加成反应，还催化乙酰CoA和丙二酰CoA的缩合反应；此外，还有riboflavin合成酶、EupfF等分子间[4+2]环化酶都是多功能的Diels-Alderase。从1928年发现D-A反应，到现在近百年，尚未发现天然的催化分子间DA反应的单功能Diels-Alderase。

▉ 本篇内容

a| 氧化酶和[4+2]环化酶的鉴定：

化合物2和3与细胞裂解物的一起孵育，主要产物为1（天然产物）及不稳定的化合物4，表明氧化酶和分子间[4+2]环化酶可能参与植物分子的生物合成。随后作者进行基于活性蛋白导向的分离试验，并通过LC-MS / MS蛋白质组学分析所富集的蛋白质是BBE样酶，可能是氧化酶和/或[4+2]环化酶。

b| 利用基于BIPs的靶标垂钓策略揭示分子间[4+2]环化酶

由于4在测定条件下不稳定，也可以和氧化酶结合，因此基于2的结构作者设计了天然产物合成中间体分子探针（Biosynthetic Intermediate Probes，BIPs）8。利用基于BIPs的靶标垂钓策略（原理如下图所示），在SEC组分中对8进行光亲和标记，然后进行pull-down测定，探针特异性沉淀出一条独特迁移速率的条带。通过LC-MS/MS数据显示，表明通过基于活性的蛋白质纯化而富集的蛋白质是BBE样酶，这暗示着桑树中的[4+2]环化酶很可能是BBE样酶。

基于BIPs靶标垂钓的原理：BIP分子8被紫外线（365nm）激活后，重氮基形成了活性的卡宾结构，能够与[4+2]环化酶共价交联，从而实现对[4+2]环化酶的垂钓。

c | 表征MaMO与MaDA的功能

在基于活性导向的蛋白分离实验和基于BIPs的靶点垂钓试验中，作者都证明了其中的氧化酶和[4+2]环化酶是BBE样酶。通过对桑树愈伤组织进行转录组测序，鉴定出14个BBE样家族蛋白，并对其中转录水平最高的两个基因分别进行表达，得到了MaMO和MaDA。当MaDA与3共同孵育时，未能检测到任何产物，在相同条件下MaMO与3共同孵育时会生成4，这表明MaMO是负责二烯形成的氧化酶。2和4与MaDA一起孵育能够生成1，说明MaDA是[4+2]环化酶。

d | 进一步的DFT计算和KIE实验

成功鉴定MaDA后，作者进一步探索其底物适应性，并对该酶促分子间[4+2]反应机理进行研究。作者通过DFT以及KIE实验证明了该酶促反应为协同但不同步的Diels-Alder反应，因此MaDA是首个从自然界中发现的、催化分子间发生[4+2]反应的Diels-Alderase。

▉  总结

1.  本文通过解析桑白皮中的活性天然产物的生物合成的关键步骤，利用一种基于天然产物合成中间体分子探针（Biosynthetic Intermediate Probes，BIPs）的靶标垂钓策略，结合基于活性的蛋白质分离及转录组测序等方法，成功在桑树愈伤组织中鉴定出两个FAD依赖的蛋白（MaMO、MaDA）。其中，MaDA为自然界中发现的首个能独立催化分子间的D-A反应的单功能酶。

2.  利用MaDA可以实现多种D-A类型的天然产物的合成,具有与普通化学合成法相比更高的立体化学专一性与效率，为天然产物的合成提供了思路。

3.  本工作中开发的“基于天然产物生物合成中间体分子探针（BIPs）靶点发现”的方法为解析天然产物生物合成途径提供了新的研究思路

参考链接：

https://www.nature.com/articles/s41557-020-0467-7.pdf

https://chemistryeurope.onlinelibrary.wileycom/doi/full/10.1002/cbic.201000173

https://www.nature.com/articles/nature01454

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